該研究研發(fā)出一種利用宿主昆蟲體內(nèi)具有免疫抑制功能的miRNAs,遺傳改造殺蟲真菌增強(qiáng)其生防效力的″以子之矛,攻子之盾″新方法,為生防菌的遺傳改良開辟了新方向。

昆蟲通過取食作物或吸血給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康造成嚴(yán)重危害。蚊蟲是瘧疾、登革熱、黃熱病、寨卡等多種疾病的傳播媒介,對人類的健康和生命安全造成了嚴(yán)重威脅。目前,蚊蟲的防治主要依賴化學(xué)殺蟲劑,但是化學(xué)農(nóng)藥的長期使用導(dǎo)致蚊蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性,迫切需要研發(fā)新的綠色替代工具來安全有效地防治蚊蟲。球孢白僵菌作為一種天然的昆蟲病原真菌,能夠通過體表侵染并殺死昆蟲,對防治刺吸式口器的蚊蟲具有獨(dú)特的優(yōu)勢,是一種環(huán)境友好型的微生物殺蟲劑。

然而,由于病原真菌一般殺蟲時間長(一般需要一周甚至更長的時間),制約了真菌殺蟲劑的廣泛應(yīng)用。這主要是由于昆蟲在與病原菌長期攻防和博弈的過程中進(jìn)化出高效的免疫防御系統(tǒng)對抗真菌的侵染所致。為此,許多研究通過高表達(dá)外源毒素或毒力蛋白等對菌株進(jìn)行遺傳改良來增強(qiáng)生防真菌殺蟲效力。但是效應(yīng)蛋白作用靶標(biāo)單一,還會導(dǎo)致靶標(biāo)昆蟲產(chǎn)生選擇性壓力,因此亟待開發(fā)多靶點、無選擇壓力、更加安全的效應(yīng)因子對殺蟲真菌進(jìn)行遺傳改良。

圖：蚊子吸蜜

Small RNA(sRNA, 主要包括miRNA和siRNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference, RNAi)是真核生物中高度保守的基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)干擾機(jī)制。miRNA在昆蟲響應(yīng)病原菌侵染的免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。王四寶團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn),sRNA可在蚊蟲與病原真菌間進(jìn)行雙向傳遞,參與調(diào)控蚊蟲免疫和病原真菌的致病性,這種突破物種界限,跨物種轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主或微生體細(xì)胞內(nèi)干擾靶基因表達(dá)的現(xiàn)象,稱為跨界RNA干擾(Cross-kingdom RNAi)。這種sRNA的雙向跨界傳遞表現(xiàn)在：蚊蟲可以將自身保守的miRNA傳遞到病原真菌細(xì)胞來跨界抑制致病基因的表達(dá),抑制真菌感染^【1】；同樣,病原真菌也可以將自身上調(diào)表達(dá)的sRNA跨界轉(zhuǎn)運(yùn)到感染蚊蟲細(xì)胞內(nèi)干擾免疫基因的表達(dá)^【2】。這些前期研究提示我們或許可以利用sRNA在昆蟲與病原菌互作過程中跨界調(diào)控的功能,使其成為高效的效應(yīng)因子應(yīng)用于生防真菌的遺傳改造。

本研究中,研究人員從埃及伊蚊體內(nèi)篩選鑒定出兩個負(fù)調(diào)控其自身Toll免疫信號通路的miRNAs (miR-8和miR-375),通過基因工程改造,在白僵菌中成功構(gòu)建表達(dá)伊蚊miR-8或miR-375的工程菌株。與野生型白僵菌相比,表達(dá)伊蚊miRNAs的轉(zhuǎn)基因菌株在感染蚊蟲過程中能夠產(chǎn)生大量miR-8或miR-375,這些miRNAs能夠從真菌細(xì)胞跨界轉(zhuǎn)運(yùn)到感染的蚊蟲細(xì)胞內(nèi),分別靶向沉默伊蚊Toll免疫信號通路受體Toll5B和轉(zhuǎn)錄因子Rel1A的轉(zhuǎn)錄表達(dá),同時還激活Toll通路抑制因子Cactus的轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而下調(diào)蚊蟲抗菌肽基因表達(dá),降低蚊蟲抗真菌的免疫反應(yīng),進(jìn)而增強(qiáng)白僵菌對蚊蟲的致病力和加快蚊蟲死亡速度。

野外調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),多地蚊蟲對氯菊酯、氯氰菊酯等各類化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性,嚴(yán)重影響蚊蟲防治效果。為驗證蚊蟲免疫抑制性miRNAs改造的白僵菌是否對抗性蚊蟲有防治效果,研究人員對具有多種殺蟲劑抗藥性的埃及伊蚊Jinghong品系進(jìn)行測試,發(fā)現(xiàn)表達(dá)miR-8或miR-375的工程菌株比野生型菌株表現(xiàn)更強(qiáng)的殺蟲效果,縮短半數(shù)致死時間(LT50)達(dá)30%左右。

研究人員進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-8和miR-375在埃及伊蚊、岡比亞按蚊、小菜蛾等多種害蟲中序列保守,靶基因預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)miR-8和miR-375都能靶向這些昆蟲的Toll免疫信號通路相關(guān)基因。為驗證表達(dá) miR-8或miR-375的工程菌株是否對其它害蟲也有防治效果,研究人員對鱗翅目害蟲大蠟螟進(jìn)行測試,發(fā)現(xiàn)表達(dá)miR-8和miR-375的菌株對大蠟螟呈現(xiàn)較強(qiáng)的致病力,顯著加速白僵菌對大蠟螟的擊倒時間,能夠縮短半數(shù)致死時間(LT50)達(dá)20%-40%左右,共表達(dá)miR-8和miR-375對菌株毒力有顯著增效作用。

圖：利用病原菌介導(dǎo)的RNAi (pathogen-mediated RNAi,pmRNAi)提高生防真菌殺蟲效力

該研究中王四寶研究員團(tuán)隊利用″以子之矛,攻子之盾″的策略,首次開發(fā)出一種利用生防菌表達(dá)寄主miRNAs跨界干擾害蟲基因的表達(dá)來提高生防菌殺蟲效力的新方法(pathogen-mediated RNAi,pmRNAi)。pmRNAi方法具有以下多重優(yōu)點：

1)使用寄主來源的miRNA進(jìn)行菌株改良可避免害蟲產(chǎn)生抗性選擇壓力,因為昆蟲對自身免疫和生理健康至關(guān)重要的內(nèi)源性miRNA不易產(chǎn)生選擇抗性；

2)相對于外源毒素或毒蛋白基因,使用害蟲自身的miRNA可以消除公眾對工程菌株生物安全性的擔(dān)憂；

3)某些昆蟲來源的miRNAs具有種屬特異性,因此可通過定制害蟲特異的miRNA來改良菌株,提高工程菌的寄主靶向性和特異性；

4)相對于靶標(biāo)單一的殺蟲毒蛋白,miRNA具有多靶標(biāo)特性,單個miRNA可在一個或多個途徑中靶向多個基因以發(fā)揮其生物學(xué)功能,而且一個靶基因的表達(dá)也可受到多個miRNAs的組合調(diào)控；

5)在理論上一個菌株中可表達(dá)多個寄主miRNAs,從而實現(xiàn)對害蟲免疫或其他生理過程的重要靶基因或通路的操控,有效提高真菌殺蟲劑的防治效果,使得該方法在生防菌的遺傳改良上具有巨大的應(yīng)用潛力。

該研究利用豐富的寄主miRNAs改造生防菌,為開發(fā)安全和高效的真菌等生物殺蟲劑開辟了新方向和新思路,為昆蟲與病原體相互作用研究提供新的思路。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111527

參考文獻(xiàn)

【1】Cui C, Wang Y, Liu J, Zhao J, Sun P, Wang S. A fungal pathogen deploys a small silencing RNA that attenuates mosquito immunity and facilitates infection. Nat Commun. 2019,20;10(1):4298. doi: 10.1038/s41467-019-12323-1.

【2】Wang Y, Cui C, Wang G, Li Y, Wang S. Insects defend against fungal infection by employing microRNAs to silence virulence-related genes. Proc Natl Acad Sci USA. 2021,11;118(19):e2023802118. doi: 10.1073/pnas.2023802118.